HPLC
En pocas palabras La HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) es un método de separación en el que una muestra se bombea a alta presión a través de una columna. De la proporción de área del pico principal en el cromatograma resulta la pureza en porcentaje.
El método consta en el certificado de cada laboratorio. En el registro de EspañaPeptide, APIGENEX s.r.o. mide por HPLC; Liquilabs s.r.o. emplea Peptide Screening con identificación por tiempo de retención y espectro. Por eso el método se indica laboratorio por laboratorio y no de forma global para todo el registro.
Una pureza por HPLC es un valor de área cromatográfica. No dice nada sobre el contenido de agua, los contraiones ni el contenido peptídico absoluto de un vial.
La HPLC responde a qué tan limpia está la muestra, no a si se trata de la sustancia correcta. Esa segunda pregunta la resuelve la espectrometría de masas a través de la masa molecular. Solo ambos métodos juntos dan una afirmación sólida.
Lo decisivo en la práctica es que un porcentaje sin método carece de valor. Dos laboratorios pueden medir el mismo lote y llegar a cifras distintas si emplean columnas, gradientes o longitudes de onda de detección diferentes. Por eso el método pertenece al informe, y por eso la biblioteca de certificados lo indica por laboratorio.
El área bajo el pico principal se refiere al área total de todos los picos. Todo lo que la columna no muestra como pico (agua, sales, el contraión) no entra siquiera en ese cálculo. Esa es la razón de que el contenido peptídico y la pureza por HPLC sean dos cifras distintas que pueden ser ambas correctas.
Para la purificación posterior a la síntesis se usa la misma técnica a mayor escala, entonces llamada HPLC preparativa. Allí el objetivo no es medir, sino recoger la fracción limpia.